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        革兰氏染色液技术

        文章出处:本站 人气:5278 发表时间:2019-03-23 12:58:32


        作者经过对比试验,研究了菌龄、涂片厚度、媒染时间、脱色时间的变化对革兰氏染色液结果的影响。结果表明:革兰氏染色时,大肠杆菌培养24h左右为宜,而枯草芽孢杆菌培养15h左右为宜;涂片厚度应均匀薄片;媒染时间控制在60s;脱色时间应严格控制在25~30s。
        关键词: 大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 革兰氏染色 影响因素
        革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的种重要的鉴别方法,而实验成功率低,常常出现假阳性或假阴性的结果,对初学者来说难度较大。因此,我们选取大肠杆菌作为G代表,枯草芽孢杆菌作为G代表,分析影响革兰氏染色结果的各种因素,提高染色结果的准确性。
        1.实验材料
        1.1菌种:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
        1.2试剂:草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、番红染液。
        2.实验方法和结果
        2.1菌龄对染色结果的影响
        革兰氏染色要求菌种被染色时处于活跃生长期。大肠杆菌的活跃生长期为24h左右,枯草芽孢杆菌活跃生长期为在14~16h,故对不同培养时间的菌种分别选择10个时间段进行革兰氏染色观察。实验结果见表1。
        由表1可见,培养时间对染色结果影响较大,不同菌种对培养时间有不同要求。处于活跃生长期的菌体细胞结构为典型,能正确反映染色的结果。其中,大肠杆菌培养24h左右为宜,而枯草芽孢杆菌培养15h左右为宜。
        2.2涂片厚度对染色结果的影响
        用直径3mm的接种环分别挑起培养24h左右的大肠杆菌和培养15h左右的枯草芽孢杆菌满环、半环、更少量涂片,从中央向外围涂开,使细菌在小滴生理盐水中涂成直径约1cm的菌膜,堆积密度由浓厚到均匀分散,作革兰氏染色观察。结果显示:涂片浓厚时,大肠杆菌因密集脱色不完全而呈阳性反应,枯草芽孢虽呈阳性但是染色均匀度欠佳;涂片太薄,菌体过于稀少,观察时寻找视野较麻烦。因此,只有在菌膜厚度均匀分散、肉眼能见无菌生理盐水稍显浑浊时,才能得到较佳的染色结果。
        2.3媒染时间对染色结果的影响
        将培养24h左右的大肠杆菌和培养15h左右的枯草芽孢杆菌革兰氏染色,碘液作为媒染剂,覆盖时间分别为30s、60s、90s、120s。实验结果见表2。
        由表2可见,媒染时间过短,不利于结晶紫—碘的复合物与细胞之间的结合,可能造成枯草芽孢杆菌(G)呈假阴性的结果,但对大肠杆菌(G)无影响;反之,媒染时间过长,结合过于牢固,容易造成大肠杆菌(G)假阳性的结果,但对枯草芽孢杆菌(G)影响非常小。因此,媒染时间应控制在60s为宜。
        2.4乙醇脱色对染色结果的影响
        脱色是影响革兰氏染色的关键步骤,脱色时间直接关系到染色结果的准确性。我们选择10s至60s的脱色范围,分6个时间分别进行实验。实验结果见表3。
        由表3可见,脱色程度不够,大肠杆菌(G)可被染成假阳性,对枯草芽孢杆菌(G)影响较??;脱色过度,枯草芽孢杆菌(G)容易成假阴性,对大肠杆菌(G)影响较小。这是由于酒精脱色时间长使得细胞壁中脂类物质易被溶解,细胞通透性增大,导致结晶紫—碘复合物易被抽提出来;反之,脱色时间短,复合物就不易从细胞壁中逸出,而两种菌种化学组成有差别,染色受影响程度不样。因此,革兰氏染色时,定要严格控制酒精脱色时间,般以25~30s为宜。
        3.结果分析
        通过以上实验和分析,我们认为菌龄、细菌密集程度、媒染时间、酒精脱色程度这几个因素都会影响革兰氏染色液结果的正确性,同时还受干燥、固定等操作的影响。因此在进行革兰氏染色实验教学和科研工作中,除操作正确适当外,更重要的是选择适合的菌龄和准确把握脱色时间,这样才能保证染色结果的正确性。


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